平面光顯微鏡

三維成像需要光學顯微鏡具有斷層掃描的功能，這就需要分辯聚焦和非聚焦背景光。常見的熒光光學斷層是共聚焦和雙光子，但人們始終在探索新的手段，可以高速，廣視場，與長時間成像。這里有兩個技術(shù)：平面照射和結(jié)構(gòu)照射。用過顯微鏡的人都知道，當樣品不聚焦時成像會模糊不可分辯，這是成像中的頭疼問題，尤其是對厚樣品成像，這是只有一小部分樣品聚焦，而不在聚焦的部分就會模糊的背景信號。普通的熒光顯微鏡是沒有掃描功能的，這里有兩個策略可以考慮，第一個是比較直接就是不產(chǎn)生非聚焦的光信號，沒有非聚焦光當然就沒有背景了。二是常有的方法即剔除非聚焦面來的光，不光在探測之前還是之后，把它從圖像中去除，二者各有所長。不產(chǎn)生非焦平面光的是雙光子，熒光信號只在聚焦面上由于光與物質(zhì)非線性相互左右很小的體內(nèi)內(nèi)產(chǎn)生，因此非聚焦本質(zhì)上就沒有。第二中方法的代表是共聚焦激光掃描顯微鏡，這里光與物質(zhì)作用是線性的，熒光信號在聚焦面的上下都有，但隨后非聚焦面來得光被小孔濾過。有人對共聚焦和雙光子也稱作單光子和雙光子掃描顯微鏡。

平面照射顯微鏡就是用超薄光從樣品側(cè)面照射，激發(fā)了樣品的一個二維斷層面。發(fā)射的熒光從樣品的上面或下面成像，探測器放置在垂直于照射平面的光軸上。在理想情況下，照射平面的上面和下面是不會發(fā)出熒光的，意味著平面照射顯微鏡提供了內(nèi)在光學掃描功能基于不產(chǎn)生非聚焦熒光的原理。這個思想起源于1903年，當時平面照射通過光散射成像來研究膠體溶液。直到最近熒光平面顯微鏡在生物成像中逐漸發(fā)展。目前有兩種平面照射顯微鏡，兩個都是寬場成像并有數(shù)字照相機，但照射的策略不同。在寬場照明策略中，照明光平面是靜止的并散布在整個視場。在線掃描照明策略中，光平面是通過側(cè)面小直徑光束的全視場掃描形成，在曝光過程中形成平面。在討論優(yōu)缺點時，重溫我們熟知的激光掃描顯微鏡中的點掃描照明策略，激光照射到樣品的上面并聚焦在一個點上，然后在二維平面?zhèn)认驋呙?。激光掃描顯微鏡中的信號探測用是采用單元素探測器，一般是光電二級管或血崩光電二級管。如此，激光掃描顯微鏡的象素大小，就是圖像上連續(xù)掃描點間的距離，可以選擇任意值。

藍色是激發(fā)光部分，綠色是采集光路。圖(e)到(f)就是Zeiss公司=商品化的SPIM的原理。

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