激光顯微切割是顯微觀察和分子生物學(xué)研究之間的橋梁。它將在顯微鏡下觀察到的目標(biāo)細(xì)胞直接用激光取出，從而與旁鄰的其他細(xì)胞分開(kāi)，并且可以將目標(biāo)細(xì)胞放入試管中進(jìn)行分子生物學(xué)的分析研究。

從激光類(lèi)型和技術(shù)原理上分，目前主要存在基于近紅外激光(810nm波長(zhǎng))的激光捕獲顯微切割和基于紫外激光(337~355nm波長(zhǎng))的激光顯微切割兩種。

利用激光分離細(xì)胞的研究開(kāi)始得較早，但是直到1996年基于近紅外激光熔膜原理的激光捕獲顯微切割(laser capture mierodissection，LCM)成功應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞的切割和DNA、RNA分析后，這一技術(shù)才在生物研究中迅速發(fā)展并被廣泛應(yīng)用。而在植物研究中的成功應(yīng)用，則又滯后了6年。2003~2005年間，激光顯微切割技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用逐漸發(fā)展，越來(lái)越受重視。

激光捕獲顯微切割技術(shù)(LCM)是在組織切片上方懸著機(jī)械臂控制的收集管，收集管的塑料帽表面有一層乙烯乙酸乙烯酯(Ethylene Vinyl Acetate，EVA)的熱塑膜，在顯微鏡下選擇好目標(biāo)細(xì)胞后，發(fā)射低能紅外激光脈沖，瞬間升溫使EVA膜融化與目標(biāo)細(xì)胞黏合再迅速凝固。接著目標(biāo)細(xì)胞就粘附在塑料帽表面的EVA膜上并隨著塑料帽一起移走。將塑料帽蓋在裝有緩沖液的離心管上，分離的細(xì)胞就轉(zhuǎn)移至離心管中，從而可以分析出目標(biāo)細(xì)胞的分子生物學(xué)特征，用于進(jìn)行后續(xù)研究。

激光顯微切割技術(shù)(LMD)需要將標(biāo)本切片裝片在薄膜載玻片或者薄膜覆蓋的玻璃載玻片上。脈沖紫外激光(UV-A)通過(guò)物鏡聚焦在切片上，沿著目標(biāo)區(qū)域的邊緣移動(dòng)切割，使選擇區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞脫離下來(lái)且周?chē)M織完好。

德國(guó)PALM公司出售的LMD系統(tǒng)采用的是倒置顯微鏡，切割后目標(biāo)細(xì)胞群由激光微切割彈射系統(tǒng)(Laser Microdissection and Pressure Catapulting， LMPC)彈進(jìn)放在樣品之上的微型管中。而德國(guó)Leica公司的Leica AS LMD采用的是正置顯微鏡，切割的組織細(xì)胞借助自身重力掉落至載物臺(tái)下的微量離心管中，避免了污染。

3.1 方法快速、簡(jiǎn)便、易行

激發(fā)激光、轉(zhuǎn)運(yùn)膜捕獲目的細(xì)胞，一步完成，易掌握，易操作，有利于科研和臨床診斷領(lǐng)域推廣應(yīng)用。與常規(guī)的顯微切割技術(shù)相比避免了繁瑣的操作以及無(wú)關(guān)細(xì)胞和碎片的污染。每片轉(zhuǎn)運(yùn)膜可經(jīng)受1 000~3 000次激光脈沖，捕獲6 000個(gè)以上的細(xì)胞。每次激發(fā)耗時(shí)不超過(guò)1秒，可在極短的時(shí)間內(nèi)獲得大量單一類(lèi)型的細(xì)胞。

3.2 準(zhǔn)確度高

激光定位的準(zhǔn)確程度可以達(dá)到1μm，捕獲點(diǎn)范圍達(dá)到3~5μm，因而足以捕獲單個(gè)細(xì)胞，同時(shí)還可以根據(jù)細(xì)胞的形狀、大小調(diào)整激光束的功率和直徑。

3.3 細(xì)胞形態(tài)保持完好

與手工顯微切割對(duì)組織細(xì)胞研磨破壞不同，LM在顯微鏡直視下，使用多聚體膜捕獲目的細(xì)胞，無(wú)損傷破壞，保持了其完整的組織形態(tài)，并在計(jì)算機(jī)上記錄下被捕獲前后的影像，既有利于保證捕獲的準(zhǔn)確性，也使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更可信、更具說(shuō)服力。另外，LM并未破壞切片中剩余組織，完全可以在分子水平對(duì)相鄰細(xì)胞(群)進(jìn)行對(duì)比分析研究，這是以往的顯微切割方法所無(wú)法比擬的。

3.4 細(xì)胞內(nèi)分子結(jié)構(gòu)保持完整

轉(zhuǎn)運(yùn)膜輕微、短暫的溫度變化對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA、mRNA以及蛋白質(zhì)均無(wú)損傷，熱塑性粘合避免了分子間的交聯(lián)反應(yīng)，其良好的水溶性也保證了下一步提取DNA、mRNA以及蛋白質(zhì)的順利進(jìn)行。

3.5 特異性強(qiáng)

LM可以從免疫組化染色的組織切片中分離、純化具有不同抗原表型的細(xì)胞群加以研究，大大地增加了取材的特異性、目的性。

 

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